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Wie Molekularbiologen Zellen zählen
"Schatz, geh schon mal Duschen, ich pack die Koffer aus."
Der Fachmann rät jedoch zur Vorsicht.
Nach längeren Standzeiten sammeln und vermehren sich Legionellen im Duschkopf und der Erste der duscht bekommt die ganze Ladung ab.
Wie kann ich Zellen zählen?
Leider können wir die Zellen nicht so einfach sichtbar machen und zählen, mit einem Mikroskop und einer Zählkammer könnte man das schon machen, doch viele Proben enthalten die Bakterien vermischt oder gebunden an festem Substrat und dann wird es schwierig.
Sind Legionellen Freischwimmer? Und was sind Biofilme?
Zum Beispiel: Legionellen sind in sogenannten Biofilmen gebunden, also keine Freischwimmer. Biofilme sind einige mm bis einige cm dicke glibberigen, schmierige Beläge, die man zuverlässig an den Wandungen in Abwasserrohren findet, aber auch in Aquarienschläuchen bis hin zu Wänden von Kühltürmen. Das sind ganz eigene Biotope, die auch aus Protozoen wie Amöben, Kalk und Schmutz-Ablagerungen bestehen.
Ähnliche Ablagerungen können sich auch in Duschköpfen und Wasserleitungen bilden. Das Problem ist nun, dass Legionellen von Amöben aufgenommen werden und sich gegen einen Verdau in den Nahrungsvakuole mit bestimmten Proteinen (MIP) auf ihrer Zellwand wehren können. Und noch schlimmer manche Legionellen Stämme können sich in den Vakuolen vermehren und behalten auch ihren Schutz, wenn Sie von menschlichen Immunzellen angegriffen werden.
Wie kommen die Legionellen in den Körper?
Drehen wir die Dusche kräftig und plötzlich auf, kommt es zu Druckveränderungen im Leitungssystem und Teile der Biofilme können abreißen, Amoeben können platzen und Ihre Legionellen Ladung freisetzen. Die Aerosole gelangen dann mit Legionellen in die Lunge und können eine Lungenentzündung in Form der Legionärserkrankung auslösen.
Doch nicht alle Leitungen sind kontaminiert mit Legionellen und jetzt kommt die Molekularbiologie ins Spiel: wir können nämlich stellvertretend für die Legionellen Zellen auch die DNA messen (Kursmodul: Quantifizierung der DNA mittels qPCR; Kurs: Real-time PCR-Kurs) und wenn wir wissen wieviel DNA eine Legionelle (Kursmodul: Genomaufbau), sogenannte Genome Unit [GU] enthält, können wir hochrechnen wie viele Legionellen sich in der Probe befinden.
Die Standard-Kurve ist der Auftrag der Cp (Ct-Werte) der qPCR-Reaktion gegen die Konzentration der Legionellen in den Standard-Proben. Der rote Punkt zeigt die unbekannte Probe dessen Konzentration sich auf der X-Achse (Konzentration (Kopien in ul)) ablesen lässt. Details dazu lernen Sie in unseren Kursen: Modul: Standard-Kurve oder im real-time PCR-Basiskurs.
Wie komme ich von der Konzentration auf die Zellzahl?
Dazu muss ich wissen, wie groß das Genom einer Legionelle ist, in der Standard-Kurve habe ich alles schon ausgerechnet und die Achsenbeschriftung lautet Kopien/ul.
Aber wie kommt man von dem Gewicht des Legionellen Genoms auf die Kopienzahl?
- Aus der Internet-Datenbank NCBI suchen Sie sich die Genom-Sequenz heraus: Legionella pneumophila genome - Nucleotide - NCBI (nih.gov)
- Dann wissen Sie das Genom ist ca. 3,4*10E6 Basenpaare groß.
- Jetzt können Sie über das Gewicht eines Basenpaare errechnen, dass ein Genom etwa 3,4 fg ist.
Die genaue Rechnung finden Sie in unserem Kurs: real-time PCR-Basis-Kurs dort finden Sie die Berechnung und auch das Protokoll für die Verdünnungsreihe.
Wie lautet der Pipettierplan?
