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Institut für Polymorphismus- und Mutationsanalytik

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Inhalte & Lernziele

Die Real Time PCR hat sich als Standard-Methode für den Nachweis und die Quantifizierung von DNA und RNA etabliert. Neben den theoretischen Grundlagen sind in diesem Kurs das Primer-Design und die Auswahl der richtigen Detektionssonden sowie die Quantifizierung und Auswertungsmöglichkeiten der Real Time PCR zentrale Themen. Sie erhalten weitergehende Informationen über unterschiedliche Detektionsformate und Geräteplattformen und diskutieren deren Vor- und Nachteile.   

Im theoretischen Teil werden u.a. folgende Themen behandelt:

  • Grundlagen des biochemischen Aufbaus und der Struktur von DNA und RNA
  • Prinzip der Real Time PCR und unterschiedliche Detektionsformate (Eva-Green, Taqman-Sonden, Molecular Beacons etc.)
  • Grundlagen der Real Time PCR: Ct-Werte, Threshold, Baseline, Schmelzkurve, High Resolution Melt
  • Auswertung der Daten, Ableitung von Effizienz und deltaCT
  • Auswahl und Analyse der geeigneten endogenen Referenz (GeNorm-, Bestkeeper-Analysen)
  • Primer-Design und die Auswahl der Detektionssonden
  • Trouble shooting

Der Praxisteil umfasst:

  • Bestimmung der Standard-Abweichung in technischen Replikaten
  • Nachweis und Quantifizierung von Legionellen mittels Standardkurve (LOD, LOQ)
  • Präparation von RNA und Synthese von cDNA
  • Relative Quantifizierung in einer Genexpressionsstudie am Beispiel der Kursdaten
  • Verschiedene Auswertungsmethoden
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